1- مقدمه ای بر محاسبه حد تشخیص LOD و حد تعیین کمی LOQ

بر اساس الزامات استاندارد ISO/IEC 17025:2017 و ISO 15189:2022 یکی از ویژگی های عملکردی روش که هنگام تصدیق یا صحه گذاری روش های آزمون بایستی مورد بررسی قرار گیرد حد تشخیص (LOD) و حد کمی شدن یا حد تعیین کمی (LOQ) می باشد. کارکنان آزمایشگاه در موارد کاربرد برای آزمون کمی و آزمون های کیفی خود مطابق با الزامات استاندارد ایزو 17025 و ایزو 15189 مقادیر حد تشخیص (LOD) و حد تعیین کمی (LOQ) تعیین نمایند و مناسب بودن آن را برای استفاده مورد نظر بررسی نمایند. در این پست در نظر داریم نحوه محاسبه حد تشخیص (LOD) و حد تعیین کمی (LOQ) را برای آزمون های کمی با استفاده از نتایج آزمون بدست آمده بر روی یک نمونه بلانک را تشریح نماییم. برای آزمون های کیفی نیز می توان حد تشخیص (LOD₅₀) تعیین نمود که نحوه انجام این کار همراه با یک مثال عددی در پست آموزشی “تعیین حد تشخیص در آنالیزهای کیفی (LOD 50% و LOD 95%) با استفاده از نرم افزار Analyse-it” آورده شده است.

2- تمایز بین حد تشخیص دستگاه و حد تشخیص روش آزمون

تمایزگذاری بین حد تشخیص دستگاه و حد تشخیص روش آزمون نیز ضروری است. حد تشخیص دستگاه می‌تواند بر پایه آنالیز یک نمونه پایه‌گذاری شود که اغلب واکنشگر بلانکی است که به طور مستقیم (یعنی هرگونه مراحل تهیه نمونه در آن حذف شده) یا به صورت نسبت سیگنال به نویز، برای مثال یک کروماتوگرام به دستگاه معرفی می‌شود.

جهت دستیابی به حد تشخیص متد LOD، می‌بایست بر اساس آنالیز نمونه‌هایی که تمام مراحل روش اجرایی اندازه‌گیری را پشت سر گذاشته‌اند و استفاده از نتایج محاسبه شده با معادله یکسان برای نمونه‌های آزمایشی، پایه‌گذاری شود. این روش حد تشخیص، مفیدترین روش صحه‌گذاری متد می‌باشد.

3- تعیین انحراف استاندارد در سطوح پایین:

LOD و LOQ، معمولاً با ضرب انحراف استاندارد (s’₀) در یک فاکتور مناسب محاسبه می‌شوند. مهم است که این انحراف استاندارد، نماینده دقت به دست آمده برای نمونه‌های آزمایشی نوعی باشد و اندازه گیری‌های تکراری کافی نیز جهت ارائه تخمین مناسب در آن لحاظ شده باشد.

4- نمونه‌های مناسب برای تخمین LOQ و LOD:

نمونه‌های استفاده شده می‌بایست ترجیحاً یا الف) نمونه‌های بلانک، یعنی ماتریکس‌هایی که شامل آنالیت غیرقابل تشخیص هستند و یا ب) نمونه‌های آزمایشی با غلظت‌های آنالیت نزدیک به LOD و یا زیر LODمورد انتظار باشند. نمونه‌های بلانک برای روش‌های آزمونی که در آنها یک سیگنال قابل اندازه‌گیری برای یک بلانک به دست می‌آید، مثل اسپکتروفتومتری و اسپکتروسکوپی اتمی مناسب می‌باشند. با این حال، برای تکنیک‌هایی نظیر کروماتوگرافی که مبتنی بر تشخیص پیک بالای نویز می‌باشد، نمونه‌هایی با سطوح غلظت نزدیک LOD یا بالای LODنیاز می‌باشند. این نمونه‌ها را می‌توان برای مثال با، نشانه‌ گذاری یک نمونه بلانک تهیه کرد. در راهنمای یوراکم انواع نمونه های شاهد یا بلانک که می‌توان از آنها در فرایند تصدیق یا صحه گذاری روش‌های آزمون بر اساس الزامات استاندارد ایزو 17025 و ایزو 15189 استفاده نمود تشریح شده است. برای انتخاب نمونه شاهد یا بلانک مناسب برای تصدیق یا صحه گذاری روش های آزمون توصیه می شود این راهنما مطالعه شود. 

دانلود راهنمای یوراکم در خصوص انواع بلاک ها در صحه گذاری روش های آزمون

وقتی نمونه‌های بلانک یا نمونه‌های آزمایشی در غلظت‌های پایین در دسترس نباشند، اغلب بلانک‌های واکنشگر استفاده می‌شوند. چنانچه این بلانک‌های واکنشگر کل روش اجرایی اندازه گیری را پشت سر نگذاشته و به طور مستقیم به دستگاه معرفی شوند، محاسبه انجام شده بر پایه این اندازه گیری‌ها LOQ/LODدستگاه را ارائه خواهد داد.

5- برخی نکات مهم برای محاسبه حد تشخیص (LOD) و حد تعیین کمی (LOQ)

برای تعیین درست حد تشخیص (LOD) و حد تعیین کمی (LOQ) باید از موارد زیر را در نظر گرفت:

• پوشش‌دهی دامنه‌ی کاربرد متد: برای متدهای با دامنه پوششی ماتریکس‌های بسیار متفاوت، ممکن است تعیین انحراف استاندارد هر ماتریکس به طور جداگانه الزامی باشد.
• تضمین تکرار نمایندگی: انحراف استاندارد می‌بایست نماینده عملکرد متد، به همان شکلی باشد که در آزمایشگاه استفاده می‌شود، یعنی انحراف استاندارد می‌بایست بر اساس نتایج آزمایشی محاسبه شود که در آنها، آنالیزها دقیقاً مطابق با روش اجرایی اندازه گیری مستند شامل تمام مراحل تهیه نمونه انجام شده باشند. مقادیر استفاده شده برای محاسبه انحراف استاندارد S₀می‌بایست مطابق با واحدهای، اندازه گیری مشخص در روش اجرایی باشند.
• شرایط اندازه گیری: معمولا انحراف استاندارد تحت شرایط تکرارپذیری به دست می‌آید و این روش در این پست توضیح داده میشود. با این حال، تخمین قابل اعتمادتر می‌تواند با استفاده از شرایط دقت میانی به دست آید.
• تعداد مشاهدات: تعداد تکرارها (m) جهت دستیابی به تخمین رضایتبخش از انحراف استاندارد می‌بایست کافی باشند. نوعاً بین ۶ تا ۱۵ تکرار لازم است. اغلب در روش‌های اجرایی/ پروتوکل‌های صحه گذاری ۱۰ تکرار پیشنهاد می‌شود.
• محاسبه معدل گیری: در بسیاری از روش‌های اندازه‌گیری، میانگین تکرارها در استفاده روتین متد گزارش می‌شود. در اینجا هر تکرار با اجرای کل روش اندازه‌گیری به دست می‌آید. در این حالت، انحراف استاندارد نتایج تک، S₀ می‌بایست با تقسیم بر ریشه‌ی دوم n تصحیح شود. در اینجا ، n تعداد تکرارهای معدل گیری شده در استفاده روتین، می‌باشد.
• محاسبه اثر تصحیح‌های بلانک: اگر تصحیح‌های بلانک در روش اندازه‌گیری مشخص شده باشند، آنگاه می‌بایست در تعیین انحراف استاندارد برای محاسبه LOD یا LOQ احتیاط شود. اگر در مطالعه صحه‌گذاری، تمام نتایج با مقدار بلانک یکسان تصحیح شده به دست آیند رویکردی که در اینجا برای سادگی ارائه شده آنگاه انحراف استاندارد نتایج در مقایسه با زمانی که در عمل، نتایج با مقادیر بلانک تصحیح شده متفاوت در اجراهای مختلف به دست می‌آیند، کوچکتر خواهد بود. در این مورد so می‌بایست با ضرب در مقدار  تصحیح شود. در اینجا n تعداد مشاهدات تکراری، معدل گیری شده هنگام گزارش نتایج است، وقتی که هر تکرار با دنبال کردن کل روش اندازه گیری به دست آید و n_b تعداد مشاهدات بلانک استفاده شده برای محاسبه تصحیح بلانک می‌باشد. توجه داشته باشید که تحت شرایط دقت میانی، نتایج، با مقادیر بلانک متفاوت تصحیح خواهند شد، لذا هیچ تصحیحی برای انحراف استاندارد لازم نمی‌باشد.

نمودار: محاسبه انحراف استاندارد، S’₀ که می‌بایست برای تخمین LOQ و LOD استفاده شود. فلوچارت با انحراف استاندارد آزمایشی، S₀ شروع شده که تحت شرایط تکرارپذیری از نتایج اندازه گیری‌های تکراری روی نمونه نزدیک به غلظت صفر، محاسبه می‌شود. در اینجا یا تصحیح بلانک انجام نشده و یا تصحیح بلانک برای تمام نتایج مشخص شده در متد اعمال خواهد شد. تصحیح بلانک ممکن است بر اساس یک مشاهده بلانک تک یا بر اساس میانگین چندین مشاهده بلانک پایه گذاری شده باشد.

6- تشریح محاسبه حد تشخیص (LOD) و حد تعیین کمی (LOQ) همراه با مثال عددی

در ادامه این پست همراه با یک مثال عددی نحوه محاسبه LOD و LOQ تشریح خواهد شد.

مثال: یک تمرین صحه گذاری بر پایه آنالیز بلانک نمونه بنا نهاده شده است. تعداد ده (m) اندازه گیری مستقل از بلانک نمونه تحت شرایط تکرارپذیری انجام می‌شوند. نتایج دارای مقدار میانگین ۲mg/kg و انحراف استاندارد S₀ 1mg/kg می‌باشند.

حالت ۱: روش اندازه گیری بیان می‌کند که نمونه‌های آزمایشی می‌بایست یک بار (n=1) اندازه گیری شده و نتایج با نتیجه به دست آمده برای نمونه بلانک نمونه تک (n_b=1) تصحیح شوند. در یک سری از اندازه گیری‌ها، هر اجرا شامل تکرارهای تک نمونه‌های روتین و یک نمونه بلانک (n_b) می‌باشد. در این حالت انحراف استاندارد برای محاسبه LOD/LOQ مطابق با نمودار بالا برابر خواهد شد با:

حالت ۲: روش اندازه گیری بیان می‌کند که نمونه‌های آزمایشی می‌بایست در دو تکرار (n=2) همچنین نمونه‌های بلانک هم در دو تکرار آنالیز شوند. در یک سری از اندازه‌گیری‌ها، هر اجرا شامل دو بارتکرار (n=2) نمونه‌های روتین و دو نمونه بلانک (nb=2) می‌باشد. غلظت به دست آمده برای نمونه‌های روتین با کم کردن مقدار میانگین دو نمونه بلانک تصحیح می‌شود. در این حالت، انحراف استاندارد برای محاسبه LOD/LOQ طبق نمودار بالا، برابر، خواهد شد با:

6-1- محاسبه LOD

برای اهداف صحه گذاری، معمولاً بیان مقدار تقریبی، LOD یعنی سطحی که در آن تشخیص آنالیت مشکل ساز می‌شود، کافی است. بدین منظور از رابطه زیر استفاده می‌شود در این رابطه B1 شیب خط منحنی کالیبراسیون خواهد بود:

اگر شیب منحنی کالیبراسیون برابر با یک باشد (B₁=1) رابطه فوق به صورت زیر در خواهد آمد:

6-2- محاسبه LOQ

پایین ترین سطح آنالیت است که می‌تواند با عملکرد قابل قبول تعیین شود ” عملکرد قابل قبول” به اشکال مختلف، در راهنماهای مختلف، شامل دقت، دقت و درستی یا عدم قطعیت اندازه گیری میباشد. با این حال، در عمل LOQ در بیشتر قراردادها به صورت غلظت آنالیت، مطابق با انحراف استاندارد به دست آمده S’₀ در سطوح پایین با ضرب در فاکتور k_Q محاسبه می‌شود. مقدار پیش، فرض آیوپاک برای k_Q رقم ۱۰ است.

اگر شیب منحنی کالیبراسیون برابر با یک باشد (B₁=1) رابطه فوق به صورت زیر در خواهد آمد:

7- گزارش دهی نتایج در غلظت‌های پایین اندازه‌گیری

پس از آنکه مقادیر حد تشخیص (LOD) و حد تعیین کمی (LOQ) محاسبه گردید، از مقدار محاسبه شده هنگام گزارش‌دهی نتایج در گستره پایین استفاده می‌شود. به طور معمول وقتی نتیجه اندازه‌گیری دارای مقداری کمتر از LOQ می‌باشد، کارکنان آزمایشگاه مقدار عددی گزارش نمی‌دهند و نتیجه را به صورت “LOQ>” در گزارش آزمون درج می‌کنند. همچنین اگر نتیجه آزمون کمتر از مقدار بحرانی (critical value) بدست آید در گزارش آزمون “ND” درج می‌گردد.

مشاهده فیلم آموزشی زیر که توسط یوراکم تهیه شده است برای گزارش‌دهی نتایج در گستره‌های پایین اندازه‌گیری توصیه می‌شود.

8- سخن پایانی

امیداوریم نحوه تعیین حد تشخیص (LOD) و حد تعیین کمی (LOQ) برای برآورده سازی الزامات استاندارد ایزو 17025 و ایزو 15189 را به خوبی فراگرفته و از این مطلب لذت برده باشید. در صورت وجود هر گونه پرسشی در خصوص محاسبه حد تشخیص (LOD) و حد تعیین کمی (LOQ) می‌تواند سوالات خودتان در قسمت کامنت های این پست قراردهید. سعی خواهد شد تا جای ممکن به سئوالات مطرح شده پاسخ مناسب داده شود. همچنین در صورت نیاز به برگزاری دوره تصدیق و صحه گذاری روش های آزمون برای کارکنان آزمایشگاه یا برای دریافت خدمات مشاوره برای اخذ گواهینامه ایزو 17025 و مشاوره ایزو 15189 می‌توانید با ما تماس بگیرید.

کلمات کلیدی: استاندارد ISO 17025، استاندارد ISO/IEC 17025، استاندارد ISO15189، آموزش ISO 17025، آموزش ISO 15189، مشاوره استاندارد ISO/IEC 17025، آموزش استاندارد ISO/IEC 17025، مشاوره ایزو 17025، مشاوره استاندارد ISO 17025، مشاوره ایزو 15189، مشاوره استاندارد ISO1589، تاییدصلاحیت آزمایشگاه، تاییدصلاحیت آزمایشگاه ها، صحه گذاری روش آزمون، صحه گذاری روش های آزمون، اطمینان از اعنبار نتایج آزمون، کنترل کیفیت آزمایشگاه، کنترل کیفیت داخلی و خارجی، حد تشخیص، حد تعیین کمی، محاسبه حد تشخیص LOD، محاسبه حد تعیین کمی LOQ