تعیین حد بالایی خطی‌بودن در آزمون‌های کمی میکروبیولوژی

1- مقدمه بر حد بالایی خطی‌بودن

هر یک از روش‌های آزمون کمی در آزمایشگاه میکربیولوژی حد بالایی مطمئنی دارد. این حد، عدد واضح و ثابتی نیست بلکه منطقه‌ای از تعداد کلنی است که تعداد به ازای هر پلیت به اندازه‌ای نامطمئن است که نمی‌توان مقدار معتبری بر اساس آن تعیین کرد. به منظور تصدیق روش‌های آزمون کمی در آزمایشگاه‌های میکربیولوژی بایستی حد بالای دامنه كار برای روش مورد استفاده (حد بالایی خطی‌بودن) را تعیین نمود. بنابراین کارکنان آزمایشگاه بایستی برای آزمون‌های کمی میکربیولوژی با استفاده از یک سری آزمایش بر روی نمونه‌های با رقت‌ها متفاوت (با چندین با تکرار آزمون بر روی هر پلیت‌های مختلف) حد بالایی خطی‌بودن روش آزمون را مشخص نمایند. در این پست در نظر داریم همراه به یک مثال عددی نحوه تعیین حد بالایی خطی‌بودن در آزمون‌های شمارش کلنی‌های در آزمایشگاه میکربیولوژی را تشریح نماییم.

2- حد بالای کاری روش آزمون

تعداد میکروارگانیسم‌های هدف به ازای هر آزمونه در جایی که خطی‌بودن از بین می‌رود به عنوان حد بالایی روش آزمون در نظر گرفته می‌شود. خطی‌بودن به معنی رابطه خط مستقیم نتیجه مشاهده شده با غلظت آنالیت می‌باشد. در زمینه‌های میکروبیولوژی، خطی‌بودن پاسخ شمارش با حجم آزمونه می‌باشد. خطی‌بودن همیشه در انتهای پایین مقیاس، نزدیک به سطح شناسایی خوب است.

در روش‌های شمارش کلنی، از نظر تئوری دقت به صورت یکنواخت و به طور پیوسته (Steadily) با تعداد کلنی هدف مشاهده شده در مجموعه شناسایی، افزایش می‌یابد. حدود بالا با الزامات فاصله بین کلنی‌ها و تضمین فعل و انفعالات بین کلنی‌ها تعریف می‌شود. در عمل حد بالایی روش‌های شمارش کلنی به ازای هر شناساگر است که با موقعیت آزمون متفاوت است. شناساگر شمارش کلنی (پلیت حاوی آگار، فیلتر غشایی) به چند دلیل متراکم یا اشباع می‌شود که تعداد کلنی‌ها فقط یکی از این دلایل است. کارکنان آزمایشگاه میکربیولوژی بایستی یک طراحی آزمایش بر اساس یک سری رقت‌ها یا حجم‌ها داده‌های لازم برای تعیین حد بالای کاری را فراهم کنند. 

نمونه مایع به دقت مخلوط شده و تا غلظتی رقیق می‌شود که تعداد کلنی پیشبینی شده به ازای هر پلیت حاصل شود که تا حدی از حد بالای عملکرد شناساگر فراتر رود. سری شش یا هفت رقت‌های بعدی نسبت رقت ١ به  ٢ در هر مرحله از سوسپانسیون اولیه ادامه می‌یابد. سه پلیت موازی از هر رقت بذرپاشی می‌شود. پلیت‌ها از هر رقت با میانگین بیش از ٢٠ کلنی به ازای هر پلیت شمارش می‌شود. داده‌ها برای متناسب بودن و پراکندگی بیش از حد موازی‌ها با فرض تصادفی بودن کامل در هر مرحله به عنوان پایه صحه‌گذاری تجزیه و تحلیل می‌شود. مقدار آزمون G² کاربرد محدودی دارد. انجام آزمون‌های متناسب بودن مشابه روی نمونه‌های مختلف به تعیین بالاترین تعداد کلنی در جایی که متناسب بودن روش کافی است، کمک می‌کند.

3- نوع و تعداد نمونه‌های مورد استفاده

دامنه کاری روش را می‌توان با استفاده از نمونه‌های آلوده طبیعی، کشت‌های خالص یا نمونه‌های اسپایک شده با ماده آلوده حاوی ارگانیسم هدف تعیین کرد (برای مثال: فاضلاب برای ارگانیسم‌های روده‌ای). برای انجام این بررسی آزمون بر روی حداقل 20 نمونه لازم است. در آزمایشگاه‌های که آزمون‌های کمی میکربیولوژی را بر روی نمونه‌های آب انجام می‌دهند، توصیه شده است هنگام استفاده از فاضلاب یا آب‌های سطحی حداقل سه منبع به کار رود.

یادآوری ١: ممکن است تعیین دامنه کاری روش برای روش‌هایی که دو ارگانیسم در یک پلیت بررسی می‌شود، دشوار باشد، (برای مثال: در شناسایی همزمان مجموع کلیفرم‌ها و اشریشیاکلی در یک فیلتر غشایی). در چنین مواقعی، ممکن است در صورت وجود اشریشیاکلی در نمونه همراه با مجموع کلیفرم‌های دیگر، دامنه کاری مجموع کلیفرم و اشریشیاکلی متفاوت باشد. در  تعیین دامنه کاری برای این نوع روش‌ها، دامنه کاری باید به صورت مجموع تعداد کلنی‌های موجود بیان شود زیرا نسبت اشریشیاکلی به کلیفرم‌های دیگر از نمونه‌ای به نمونه دیگر متفاوت است.

یادآوری ٢: عامل محدود کننده دیگر در تعیین دامنه کاری، انتخابی‌بودن یک روش است (انتخابی بودن یا کارایی روش آزمون میزان کلنی‌های درست تعیین شده را نشان می‌دهد). برای مثال، روش مبتنی بر فیلتراسیون غشایی برای شناسایی مجموع تعداد کلیفرم‌ها و یا اشریشیاکلی که انتخابی‌بودن ضعیفی دارد ممکن است امکان رشد بسیاری از ارگانیسم‌های دیگر را نیز فراهم کند. رشد این ارگانیسم‌ها می‌تواند مانع رشد ارگانیسم هدف شود یا از رشد آنها جلوگیری کند. در اینگونه موارد دامنه کاری را می‌توان از نظر مجموع تعداد کلنی هدف و غیر هدف در غشا بیان کرد زیرا دامنه کاری بسیار تحت تاثیر رشد ارگانیسم‌های غیر هدف قرار دارد.

4- ارزشیابی آماری حد بالایی روش آزمون

محاسبات آماری براساس روش شاخص G² است. n را شمارش کلنی  x₁, x₂, . . ., x_n در نظر بگیرید که از روی بررسی یک سوسپانسیون آزمون از نظرحجم یا رقت به دست می‌آید که با اعداد R₁, R₂, . . ., R_n مرتبط هستند. برآورد نسبت احتمال لگاریتمی متناسب بودن (خطی‌بودن) شمارش‌ها را می‌توان از فرمول زیر محاسبه کرد:

مقدار راهنما را می‌توان با مراجعه به جداول X² با n-1 درجه آزادی به دست آورد. مقادیر بیشتر از مقدار در جدول نشان می‌دهد که از متناسب بودن در سطح احتمال مورد نظر فاصله گرفته است. در جایی که خطی‌بودن از بین می‌رود، می‌توان تعداد میکروب‌ها به ازای هر قسمت آزمون را مرز بالا در نظر گرفت.

یادآوری 3: خطی‌بودن جنبه‌ای از درست بودن است. انحراف از خطی‌بودن با افزایش تعداد کلنی‌ها به تدریج ایجاد می‌شود.

5- ارائه یک مثال عددی برای آزمون خطی‌بودن

نمونه طبیعی از قبل تا سطح مناسبی رقیق شده و یک سری رقت در شش مرحله متوالی با نسبت ١ به ٢ تهیه می‌شود. پلیت‌های موازی از هر رقت با استفاه از تکنیک انتشار در سطح ایجاد می‌شود. کلنی‌ها بعد از مدت زمان گرمخانه‌گذاری شمارش می‌شوند و نتایج در جدول زیر نشان داده شده است.

جدول بندی شمارش‌ها در آزمون خطی‌بودن

5-1- آزمون متناسب بودن کلی

مطابقت مجموع تعداد کلنی موازی با حجم نسبی مربوطه 1/2/4/8/16/32 با استفاده از مجموع G² کلی و موازی (طبق فرمول بخش قبل) به صورت زیر محاسبه شده است:

درجه آزادی آماری آزمون ٥=١-٦ است. مقدار شاخص با توزیع X² با 5 درجه آزادی مقایسه شده است که معادل با 11.070 برای 5% و  15.086 برای 1% می‌باشد. مقدار محاسبه شده از مقدار تئوری برای %١ (15.086) فراتر می‌رود یعنی خطی‌بودن کلی نتایج ضعیف است.

5-2- تفسیر داده‌ها و مراحل بعدی

سیستم شناساگر در این نمونه در دامنه شمارش کلنی‌ها از ١٤=٣÷٤١ تا ٢٦١=٣÷٤٨٣ به ازای هر پلیت، خطی نمی‌باشد. از روی بررسی شمارش‌ها به ازای حجم نسبی (S_i/R_i) می‌توان مشاهده کرد که تعداد بالای کلنی، بیشترین انحراف را از حد پیشبینی شده دارد. در چهار رقت از ^3-2 تا ^6-2 شمارش‌ها به ازای حجم نسبی (S_i/R_i) تقریبا ثابت، و به طور میانگین حدود ٤٣ است. تغییر ناگهانی بین رقت‌های ^٣–٢ و ^٢–٢ اتفاق افتاده است. شناساگر حتی قبل از 160 کلنی به ازای هر پلیت غیرکاربردی می‌شود زیرا کلنی‌ها کمتر از میزان پیش‌بینی شده برای رقت ^٢–٢ و ^١–٢ رشد کرده است. نسبت ٢ به ١ بین رقت‌های متوالی در تعداد شمارش کلنی در غلظت‌های بالا دیده نشد، که نشان می‌دهد در غلظت‌های بالای کلنی، نتایج خطی نمی‌باشد. 

همان تجزیه و تحلیل متناسب بودن را می‌توان برای شمارش اولین رقت، تکرار کرد. مطابقت مجموع پنج رقت محاسبه شده است.

مقادیر مرجع برای آمار آزمون با چهار درجه آزادی 9.488 برای 5% و 13.772 برای 1% است. مرحله بعدی آزمون متناسب بودن (آزمون خطی‌بودن)، برای چهار رقت است.

مقادیر مرجع با سه درجه آزادی 7.815 برای 5% و 11.345 برای 1% بسیار بالاتر از مقدار مشاهده شده 2.328 است. هیچ نشانه‌ای از انحراف سیستماتیک ناشی از متناسب‌بودن (خطی‌بودن) در چهار رقتی که با میانگین شمارش 107 شروع می‌شود، دیده نمی‌شود. می‌توان نتیجه گرفت که خطی‌بودن فقط با رقیق‌تر شدن نمونه دیده می‌شود. نقطه‌ای که در آن خطی‌بودن دیده نمی‌شود، بلافاصله بعد از اینکه تعداد کلنی به ازای هر پلیت بیشتر از حدود 100 می‌شود، حد بالای روش را تعیین می‌کند.

6- سخن پایانی

در این پست همراه با یک مثال عددی بر اساس استاندارد ISO 13843 نحوه تعیین حد بالای کاری روش‌های آزمون در آزمایشگاه‌های میکربیولوژی تشریح گردید. این روش فقط با آزمون‌های شمارش کلنی‌ها در آزمایشگاه میکربیولوژی قابل استفاده است. برنامه مشابهی را می‌توان با حداقل بیست نمونه برای تعیین گستره کاری روش‌های آزمون در آزمایشگاه میکربیولوژی تکرار کرد. در صورت وجود هر گونه پرسشی در خصوص تعیین گستره کاری برای روش‌های آزمون در آزمایشگاه می‌توانید سوالات خود را در قسمت کامنت‌های این پست قرار دهید. سعی خواهد شد تا جای ممکن به سئوالات مطرح شده پاسخ مناسب داده شوند. همچنین در صورت نیاز به برگزاری دوره آموزشی صحه گذاری روشهای آزمون با نرم‌افزار Minitab برای کارکنان آزمایشگاه یا برای دریافت خدمات مشاوره برای اخذ گواهینامه ایزو 17025 و مشاوره ایزو 15189 می‌توانید با ما تماس بگیرید.