1- مقدمه‌ای بر ارزیابی گزینش پذیری روشهای آزمون در آزمایشگاه

مطابق با الزامات استانداردهای سیستم مدیریت کیفیت در آزمایشگاه‌ها مانند ISO/IEC 17025:2017 و ISO 15189:2022 آزمایشگاه باید روش‌های استاندارد نشده، روش‌های تدوین شده توسط آزمایشگاه و روش‌های استانداردی كه خارج از حوزه كاربرد مورد نظرِ آن‌ها به كار گرفته می‌شوند یا روش‌های اصلاح شده را صحه‌گذاری کند. صحه‌گذاری باید تا حدی كه لازم است گسترده باشد تا نیازهای كاربرد معین یا زمینه كاربرد موردنظر را برآورده سازد. بر اساس الزامات استاندارد ایزو 15189 و ایزو 17025 برای تصدیق یا صحه گذاری روش‌های آزمون ویژگی های عملکردی روش بایستی مورد بررسی قرار گیرند. این ویژگی‌های شامل گستره اندازه گیری، درستی، عدم قطعیت اندازه گیری نتایج، حد تشخیص، حد کمی شدن،گزینش پذیری روش، خطی بودن، تکرارپذیری یا تجدیدپذیری، استواری در برابر تاثیرات خارجی یا حساسیتِ متقابل در برابر تداخل ناشی از بافت نمونه یا موضوع آزمون و اریبی ‌باشد، اما محدود به این موارد نیست. در این پست آموزشی در نظر دارای همراه با یک مثال عددی نحوه ارزیابی گزینش پذیری روشهای آزمون را تشریح نماییم.

2- اصطلاحات و تعاریف مربوط به گزینش پذیری روش های آزمون

در ابتدای این پست آموزشی به بررسی برخی از اصطلاحات و تعاریف مربوط به گزینش پذیری روش های آزمون می پردازیم.

۱-2- گزینش پذیری (Selectivity): به “میزانی که متد تا آن مقدار بتواند جهت تعیین آنالیت های خاص در مخلوط ها یا ماتریکس ها، بدون مزاحمت دیگر سازنده های با رفتار مشابه، مورد استفاده قرار گیرد” مرتبط است. تعاریف موجود در سندهای گوناگون (FDA, AOAC, EMA و Eurachem) کم و بیش با این تفسیر مطابقت دارند. آیوپاک اصطلاح “گزینش پذیری” را پیشنهاد می‌کند در حالی که در بخش‌های دیگر نظیر بخش دارویی (ICH)، از اصطلاح “ویژگی” یا “ویژگی تجزیه‌ای” استفاده می‌شود. مورد آخر جهت اجتناب از سردرگمی و اشتباه با اصطلاح “ویژگی‌تشخیصی” پیشنهاد می‌شود که در آزمایشگاه طبی استفاده می‌شود.

2-۲- اثرات مزاحمت‌ها: به طور کلی می‌توان گفت که روش‌های آزمون شامل یک مرحله اندازه‌گیری هستند که ممکن است بعد یا قبل از یک مرحله جداسازی انجام شود. معمولاً در مرحله اندازه‌گیری، غلظت آنالیت به شکل مستقیم اندازه‌گیری نمی‌شود، بلکه به جای آن یک خاصیت ویژه (برای مثال، شدت نور) به طور کمی تعیین می‌شود. بنابراین، اثبات این نکته که خاصیت اندازه‌گیری شده فقط از آنالیت ناشی شده و عامل مزاحم دیگری که از لحاظ شیمیایی یا فیزیکی شبیه آنالیت است در آن نقش ندارد، بسیار مهم است، چرا که این وضع باعث ایجاد بایاس در نتیجه اندازه‌گیری خواهد شد. لذا برای بهبود گزینش‌پذیری سیستم اندازه‌گیرنده، لازم است تا قبل از مرحله اندازه‌گیری یک مرحله جداسازی انجام شود. مزاحمت‌ها، ممکن است با کاهش یا افزایش سیگنال نسبت داده شده به اندازه‌ده باعث ایجاد بایاس شوند. اندازه اثر برای ماتریکس معین معمولاً متناسب با سیگنال است و در نتیجه گاهی “اثر تناسبی” نامیده می‌شود. این اثر شیب منحنی تابع کالیبراسیون را تغییر داده، اما بر عرض از مبدأ تأثیری ندارد. این اثر، “اثر چرخشی” نیز نامیده می‌شود.

«اثر انتقالی» یا «اثر ایستا» از یک سیگنال تولیدی توسط عوامل مزاحم موجود در محلول آزمایشی ناشی می‌شود، لذا آن مستقل از غلظت آنالیت می‌باشد. اغلب از آن با نام مزاحمت “پس زمینه” یا “خط پایه” یاد می‌شود. این اثر بر روی شیب تأثیر نداشته و عرض از مبدأ تابع کالیبراسیون را تغییر می‌دهد. معمولاً اثرات تناسبی و انتقالی به طور همزمان مشاهده می‌شوند و متد افزایش استاندارد فقط می‌تواند اثرات تناسبی را تصحیح کند.

3- ارزیابی گزینش پذیری روشهای آزمون

برای روش‌های آزمون توسعه یافته درون سازمانی، روش‌های آزمون برگرفته از مقالات علمی و متدهای منتشر شده از سوی سازمان‌های استاندارد که خارج از دامنه کاربرد تعیین شده استفاده می‌شوند، می‌بایست گزینش پذیری روش های آزمون بررسی شود. معمولاً وقتی روش‌های آزمون منتشر شده از سوی سازمان‌های استاندارد، در دامنه کاربرد مربوطه شان استفاده شوند، گزینش پذیری به عنوان بخشی از فرایند استانداردسازی روش آزمون مورد مطالعه قرار خواهد گرفت. گزینش پذیری یک روش آزمون معمولاً با مطالعه توانایی روش آزمون جهت اندازه‌گیری آنالیت مورد نظر در نمونه‌هایی که عوامل مزاحم ویژه‌ای به طور عمدی وارد آنها شده‌اند (آن عواملی که به احتمال زیاد در نمونه‌ها وجود دارند)، مورد بررسی قرار می‌گیرد. جایی که آشکار نباشد آیا مزاحمت‌ها از قبل وجود دارند یا خیر، گزینش پذیری روش آزمون می‌تواند با مطالعه توانایی روش جهت اندازه‌گیری آنالیت در مقایسه با دیگر متدهای مستقل مورد بررسی قرار گیرد. 

تکنیک‌های تأییدی می‌توانند به عنوان ابزاری جهت تصدیق ماهیت‌ها مفید باشند. هر چقدر شواهد بیشتری جمع‌آوری شود، تکنیک بهتر خواهد بود. الزاماً باید بین هزینه‌ها و زمان صرف شده برای شناسایی آنالیت و اطمینانی که با آن بتوان تصمیم‌گیری کرد که آیا شناسایی به درستی انجام شده یا خیر، توازنی وجود داشته باشد. در حالی که ارزیابی تکرارپذیری مستلزم تکرار اندازه‌گیری با یک تکنیک می‌باشد، تأیید هویت آنالیت مستلزم آن است که اندازه‌گیری چندین بار و با تکنیک‌های مختلف و ترجیحاً به شکل مستقل انجام شود. تأیید، اطمینان تکنیک آزمایشی را افزایش داده و به خصوص هنگامی که تکنیک‌های تأییدی بر اساس اصول کاملاً متفاوتی اجرا شوند، مفید می‌باشد. در بعضی از کاربردها، برای مثال، آنالیز مواد آلی مجهول با کروماتوگرافی گازی، استفاده از تکنیک‌های تأییدی ضروری می باشد. وقتی روش اندازه‌گیری ارزیابی شده به شدت گزینشی باشد، استفاده از دیگر تکنیک‌های تأییدی ممکن است ضروری نباشد. یک جنبه مهم گزینش‌پذیری که می‌بایست لحاظ شود، زمانی است که آنالیت در بیش از یک فرم نظیر فرم متصل یا غیرمتصل، معدنی یا آلی فلزی، یا حالت‌های اکسیداسیون مختلف در نمونه حضور داشته باشد. لذا در این حالت جهت اجتناب از سردرگمی، تعریف دقیق اندازه‌ده ضروری می‌باشد.

4- ارائه مثال برای ارزیابی گزینش پذیری روشهای آزمون

مثال 1: ارزیابی گزینش پذیری روشهای آزمون برای اسپکتروسکوپی

شناسایی ترکیبات مجهول در طیف‌سنجی IR با انطباق، در طیف آنالیت با سیگنال‌های جذب (یعنی «پیک‌ها») سیگنال‌های طیف‌های مرجع ذخیره شده در کتابخانه طیفی انجام می‌شود. بعد از کسب اطمینان از شناسایی صحیح، می‌بایست یک طیف ماده مرجع (RM) از آنالیت تحت شرایط کاملاً یکسان، همانند بخش آزمایشی گرفته شود. هر چه تعداد انطباق پیک‌های بین آنالیت و RM بیشتر باشد، اطمینان از این که شناسایی صحیح واقع شده یا خیر، بالاتر خواهد بود. بررسی این که چطور شکل طیف با نحوه جداسازی آنالیت و نحوه تهیه آن برای آنالیز IR تغییر می‌کند نیز ارزشمند است. برای مثال، اگر طیف به صورت دیسک نمک ثبت شده باشد، توزیع اندازه ذرات بخش آزمایشی در دیسک ممکن است شکل طیف را تحت تأثیر قرار دهد.

مثال 2: ارزیابی گزینش پذیری روشهای آزمون برای کروماتوگرافی

اثر یک پیک کروماتوگرافی به دست آمده از آنالیت مورد نظر بر این اساس که ماده مرجع (RM) شامل آنالیت نیز سیگنالی را در نقطه یکسان روی کروماتوگرام تولید می‌کند، شناسایی می‌شود. اما آیا این سیگنال ناشی از آنالیت است یا چیز دیگری که به طور تصادفی همراه با آنالیت از ستون شستشو داده شده است؟ یعنی ناشی از یک اثر ثابت؟ در واقع پیک می‌تواند ناشی از تک‌تک آنها و یا هر دوی آنها باشد. شناسایی آنالیت، از این روش، غیرقابل اعتماد بوده و به یک دلیل تأییدکننده نیاز است. برای مثال، در این حالت، جهت اثبات این که آیا سیگنال مربوطه و سیگنال تولید شده با ماده مرجع (RM) باز هم در یک زمان ظاهر می‌شوند یا خیر، می‌توان کروماتوگرافی را با استفاده از ستونی با قطبیت متفاوت و به کارگیری اصل جداسازی متفاوت، تکرار کرد. استفاده از ستونی با قطبیت مختلف جایی که پیک، ناشی از بیش از یک ترکیب باشد، روش مناسبی برای جدا کردن ترکیبات است. در بسیاری موارد می‌توان از ابزارهای طیف‌‌سنجی جرمی پیشرفته نظیرکروماتوگرافی گازی یا مایع همراه با تشخیص طیف‌سنجی جرمی استفاده کرد که دارای گزینش‌پذیری بالا می‌باشند. برای بررسی گزینش پذیری متد معمولاً دو کمیت عددی مورد بررسی قرار می‌‌گیرد. که در ادامه به تشریح این دو کمیت می‌پردازیم:

4-1- ضریب جداسازی: اولین کمیت عددی “ضریب جداسازی (separation factor)” که آن را با α نشان می‌دهند و برای شکل ۱ این ضریب به صورت زیر محاسبه می‌شود:

ضریب جداسازی برای هر دو پیک نشان داده شده در کروماتوگرام ۱ و ۲ یکسان است، اما به صورت واضح قابل مشاهده است که جداسازی در پیک کروماتوگرام ۲ به خوبی انجام نشده است. این اشکال اساسی “ضریب جداسازی (separation factor)” به عنوان مشخصه عددی جداسازی در کروماتوگرافی است.

 شکل ۱: کروماتوگرام با ضریب جدا سازی مشابه اما رزولوشن های مختلف

4-2- قدرت تفکیک پیک: دومین کمیت عددی ممکن برای بیان گزینش پذیری استفاده از “قدرت تفکیک پیک (peak resolution)” می‌باشد که آن را با R_S نشان می دهند و با استفاده از رابطه زیر  محاسبه می‌شود:

در این رابطه w_1/2 پنهای پیک در نقطه نصف ارتفاء پیک می‌‌باشد.

برای مثال نشان داده شده در شکل ۱ “قدرت تفکیک پیک (peak resolution)” به صورت زیر بدست می‌آید:

Chromatogram 1: 

 Chromatogram 2:

مقدار Rs در کروماتوگرام ۱ بهتر از کروماتوگرام ۲ است که این امر نشان می‌دهد جداسازی بهتری در کروماتوگرام ۱ انجام شده است.

در راهنمای اعتبارسنجی روش آزمون FDA بیان شده است اگر R_S> 2 گزینش پذیری روش آزمون مناسب است. این مقدار در راهنمایی AOAC برای صحه گذاری روش‌های آزمون R_S  بزرگتر از ۱٫۵ برای گزینش پذیری خوب روش ذکر شده است. علاوه بر این در راهنمای AOAC و ICH الزام شده است هیچ ترکیب دیگری در زمان ماند آنالایت هنگامی که از روش‌های آزمونی مانند IR, NMR, MS استفاده شده است، نباید قابل تشخیص باشد. 

یک مثال عددی دیگر برای محاسبه قدرت تفکیک پیک ها در شکل زیر نشان داده شده است.

در جدول زیر نحوه بررسی گزینش پذیری روش‌های آزمون به اختصار آورده شده است.

5- سخن پایانی

در این پست آموزشی نحوه ارزیابی گزینش پذیری روشهای آزمون تشریح گردید. این ویژگی‌های عملکردی روش آزمون بر اساس استانداردهای ISO/IEC 17025:2017 و ISO 15189:2022 بایستی برای صحه گذاری روش های آزمون توسط کارکنان آزمایشگاه بررسی شوند. سایر ویژگی‌های عملکردی روش که بر اساس الزامات استاندارد ایزو 15189 و ایزو 17025 بایستی مورد بررسی قرار گیرند در پست آموزشی صحه گذاری روش های آزمون (Method Validation) تشریح شده است. امیداوریم این پست آموزشی به درک بهتر تکنیک‌های مورد استفاده برای بررسی گزینش پذیرش روش های آزمون کمک نماید و از این مطلب لذت برده باشید. در صورت وجود هر گونه پرسشی در خصوص نحوه بررسی گزینش پذیری روش‌های آزمون می‌توانید سوالات خودتان در قسمت کامنت های این پست قراردهید. سعی خواهد شد تا جای ممکن به سئوالات مطرح شده پاسخ مناسب داده شود. همچنین در صورت نیاز به برگزاری دوره تصدیق و صحه گذاری روش های آزمون برای کارکنان آزمایشگاه یا برای دریافت خدمات مشاوره برای اخذ گواهینامه ایزو 17025 و مشاوره ایزو 15189 می‌توانید با ما تماس بگیرید.