1- مقدمه بر حد تشخیص در آنالیزهای کیفی:

یکی از پارامترهای مهم کیفیت اندازه‌گیری در آنالیز کیفی حد تشخیص (LOD) و حد جدایش (Cut-off) می‌باشد. حد تشخیص در آنالیزهای کیفی (LOD) شبیه آنالیز کمی تعریف می‌شود، یعنی غلظتی از آنالیت که سیگنالی را فراهم می‌کند که می‌تواند به صورت آماری از سیگنال میانگین نمونه‌های بلانک مرتبط تشخیص داده شود. چنانچه حد جدایش به درستی تعیین شود، نرخ‌های منفی کاذب برای غلظت‌های بالای حد، در یک احتمال بیان شده (به طور معمول 95%)، پایین خواهد بود. همچنین برای تصدیق و صحه گذاری روش‌های آزمون کیفی حد تشخیص (LOD) و حد جدایش (Cut-off) معمولاً به عنوان یکی از مشخص‌های عملکردی روش آزمون مورد بررسی قرار می‌گیرند. بر این اساس در این پست در نظر داریم نحوه محاسبه LOD₅₀ و LOD₉₅ را به همراه یک مثال عددی با استفاده از نرم افزار Analyse-it تشریح نماییم. 

2- برخی از اصطلاحات و تعاریف کاربردی برای تعیین حد تشخیص در آنالیزهای کیفی:

2-1- آنالیزهای کیفی (qualitative analysis):

آیوپاک آنالیز کیفی را به شکل زیر تعریف می کند:

“آنالیزی که در آن مواد بر اساس خواص شیمیایی یا فیزیکی، نظیر واکنش پذیری شیمیایی، محلولیت، وزن مولکولی، نقطه ذوب، خواص تابشی (نشر، جذب)، طیف‌های جرمی، نیمه عمر هسته‌ای و غیره شناسایی یا طبقه‌بندی می‌شوند.”

به عبارت دیگر روش‌های کیفی:

“روش‌های آنالیزی هستند که در نتیجه آن‌ها آنالیت به صورت مستقیم یا غیر مستقیم در آزمونه خاص شناسایی می‌شود و یا نمی‌شود.”

این بدان معنی است که نتایج بر اساس مقیاس اسمی بیان می‌شوند که از نظر رتبه پایین‌تر از بیان نتایج بر اساس مقیاس نسبت می‌باشد. لذا، برای اهداف غربال‌گیری که در آنها از روش‌های آزمون کم هزینه استفاده می‌شود (به عنوان مثال استفاده از روش‌های تشخیص سریع برای شناسایی افراد آلوده به ویروس کرونا) و یا در غلظت‌های آنالیت نزدیک به حد تشخیص (LOD) به جای آنالیزهای کمی عمدتاً آنالیزهای کیفی پیشنهاد می‌شوند.

2-2- آنالیت (Analyte):

آن بخشی که به عنوان کمیت قابل اندازه‌گیری بیان می‌شود.

 یادآوری 1: مفهوم آنالیت در میکروبیولوژی مواد غذایی یک میکروارگانیسم، گروهی از میکروارگانیسم‌ها یا تولیدات (برای مثال سموم) آنها می‌باشد که با استفاده از روش‌های آزمون شناسایی، شمارش یا تعیین مقدار می‌شوند.

یادآوری 2: اهداف احتمالی تکنیک‌هایی که برای شناسایی یا شمارش آنالیت بکار می‌روند، می‌تواند DNA یا RNA، پروتئین‌ها، لیپوپلی ساکاریدها و یا سایر موارد باشد.

2-3- آزمون یا روش اجرایی شناسایی (identification procedure or test)

روش اجرایی یا آزمونی که هویت آنالیت را تعیین می‌کند.

2-4- سطح جستجو و شناسایی (Detection level)

روش‌های کیفی است که حداقل غلظت ارگانیسم‌هایی که وقتی در محیط کشت معینی تلقیح شده و تحت شرایط تعریف شده‌ای گرمخانه گذاری می‌شوند، شواهدی از رشد با احتمال P=0.95 را ظاهر می‌کنند.

2-5- نتیجه آزمون منفی کاذب (False Negative test Result):

نتیجه مثبت تایید شده واقعی که با استفاده از روش آزمون شده، نتیجه منفی بدست آمده است.

2-6- نتیجه آزمون مثبت کاذب (False Positive test Result):

نتیجه منفی تایید شده واقعی که با استفاده از روش آزمون شده، نتیجه مثبت بدست آمده است.

2-7- سطح جستجو و شناسایی (level of detection LOD_X )

“روش‌های کیفی” غلظت آنالیت اندازه‌گیری شده که با روش اندازه‌گیری معینی بدست آمده است، و احتمال جستجو و شناسایی آن X است. برای مثال: LOD₅₀ سطح جستجو و شناسایی است که 50% آزمون‌ها برای آن نتیجه مثبت می‌دهد.

2-8- حد تشخیص تخمینی (eLOD₅₀):

LOD₅₀ سطح جستجو و شناسایی‌ است که 50% آزمون‌ها برای آن نتیجه مثبت می‌دهد و بر اساس طراحی آزمون‌های آزمایشگاهی شرح داده شده در استاندارد ISO 16140-3:2021 می‌باشد. 

یادآوری: تعیین صحیح LOD₅₀ در مواردی که تعداد نمونه‌های آزمون کم است امکان‌پذیر نمی‌باشد. بنابراین از اصطلاح  LOD₅₀ تخمینی در استاندارد ISO 16140-3:2021 استفاده شده است. 

3- ویژگی‌های عملکردی برای تصدیق و صحه گذاری آزمون های کیفی

اگر چه آنالیز کیفی نیز از اصول پایه آنالیز کمی پیروی می‌کند، با این حال هنگام توصیف خواص روش آزمون و تفسیر نتایج، لازم است از مفاهیم ویژه مربوط به آنالیز کیفی استفاده شود.

یک “روش آزمون کیفی” در یک غلظت جدایش معین از یک آنالیت به طور مؤثر پاسخ‌های “بله” یا “خیر” می‌دهد. در اینجا صحه گذاري شامل شناسایی غلظت جدایش به منظور طبقه بندی/ تشخیص یک حالت شرطی، براي مثال، حضور یا غیاب یک آلاینده در آب بر اساس یک قانون، دستور اجرایی و غیره می‌باشد و تعریف می‌کند که کدام غلظت جدایش می‌بایست برای آن به کار رود. 

به منظور تعیین خواص یک روش آزمون کیفی، استفاده از یک روش آزمون کمی با خواص اندازه شناسی برتر (روش تأییدی)، براي مثال، با LOD کمتر، براي تعیین حالت واقعی همراه با یک شرط و یا بدون شرط مفید می‌باشد. خواص روش کیفی می‌بایست در غلظت‌های پایین و بالای غلظت جدایش تعیین شود. استفاده از یک روش آزمون کمی تأییدی، نسبت به استفاده از نمونه‌های بلانک نشانه‌دار و فاقد نشانه، ترجیح داده می‌شود.

دقت متدهای کیفی را نمی‌توان به شکل انحراف استاندارد یا انحراف استاندارد نسبی بیان کرد، بلکه آن را به شکل نرخ های مثبت کاذب و درست و نرخ های منفی کاذب و درست بیان می‌کنند. این حالت در شکل زیر نشان داده شده است. 

به طور معمول برای تصدیق و صحه گذاری روش های آزمون کیفی “حساسیت (Sensitivity)” و “تشخیص‌پذیری یا اختصاصیت (specificity)” آنها بررسی می‌شود که نحوه بررسی آنها در پست تصدیق و صحه‌گذاری در روش‌های آزمون‌ کیفی در آزمایشگاه تشریح گردید. یکی دیگر از پارامترهای مهم کیفیت اندازه گیري در آنالیز کیفی حد تشخیص (LOD) و حد جدایش (Cut-off) می‌باشند که تعیین آنها برای بسیاری از آزمون‌های کیفی در آزمایشگاه‌های شیمیایی، میکروبیولوژی، تشخیص طبی، دامپزشکی و غیره از اهمیت زیادی برخوردار است. در برخی از مراجع (به عنوان مثال ISO 16140-3:2021) تعیین حد تشخیص (LOD) برای آنالیزهای کیفی (جستجو و شناسایی) به عنوان یکی از ویژگی‌های عملکردی مهم برای تصدیق روش‌های آزمون الزام شده است. در بخش بعد نحوه محاسبه LOD₅₀ و LOD₉₅ برای آنالیزهای کیفی با استفاده از نرم افزار Analyse-it تشریح می‌شود.

4- محاسبه حد تشخیص LOD₅₀ و LOD₉₅ در نرم افزار Analyse-it همراه با یک مثال عددی

برای تشریح نحوه محاسبه حد تشخیص LOD₅₀ و LOD₉₅ در نرم افزار Analyse-it از یک مثال استفاده خواهیم کرد. 

مثال: نتایج آزمون بر روی 20 نمونه در 7 غلظت مطابق جدول زیر است. در این جدول ستون اول غلظت‌ها که در این مثال بر حسب Log₁₀ copies/μL و ستون دوم نتایج مربوط به آنالیز کیفی است که نتایج مثبت با عدد 1 و نتایج منفی با عدد 0 نشان داده شده است. غلظت نمونه‌های مورد بررسی با استفاده از دستگاه RT PCR تعیین شده است. (دانلود فایل مثال)

یادآوری: در آزمون‌های شمیایی غلظت‌ها ممکن است بر حسب ppm یا ppb باشند و همچنین در آزمون‌های میکربیولوژی غلظت‌ها ممکن است بر حسب CFU/ml یا CFU/g باشد. 

گام ۱: نرم افزار Analyse-it‌ را دانلود و نصب نمایید. (دانلود نرم افزار)

گام ۲: فایل مثال ارائه شده را دانلود و در نرم افزار اکسل آن را باز کنید. (دانلود فایل مثال)

گام ۳: در نرم افزار اکسل به منوی Analyse-it رفته و مراحل زیر را برای محاسبه LOD 50 و LOD 95 انجام دهید:

1. Select a cell in the dataset.

2. On the Analyse-it ribbon tab, in the Statistical Analyses group, click Fit Model, and then click Probit. The analysis task pane opens.

3. In the Y drop-down list, select the Result variable, and then in the Event drop-down list, select the Positive state (1).

4. In the X drop-down list, select the RNA variable, and then click the drop-down menu icon next to the variable drop-down, and in the Transform drop-down list, select Log 10.

5. In the Plot drop-down list, select Scaled – X against Y to show the X axis as a logarithmic scale.

6. Clear the Individual check-box, and select the Aggregate check-box.

7. On the Analyse–it ribbon tab, in the Fit Model group, click Predict, and then click X given Probability.

8. On the analysis task pane, on the Fit panel, next to the Predict X given Probability, click More…, and then on the Predict X given Probability panel, click Add and select LoD=50% & LoD=95%.NOTE: If using Analyse-it pre-version 5.65, on the Fit panel, in the Predict X given Probability edit box, type 0.95.

1. Click Calculate.

5- تفسیر نتایج بدست آمده از نرم‌افزار برای صحه گذاری روشهای آزمون کیفی

نرم افزار Analyse-it به عنوان خروجی، نمودار و جدول زیر را به ارائه می‌کند. در این نمودار محور Y نرخ پاسخ مثبت را نشان می‌دهد و محور X غلظت می‌باشد (برای مثال ارائه شده غلظت بر حسب Log₁₀ copies/μL است). معادله منحنی Probit به صورت Y=-0.43 + 3.89X بدست آمده است. مقدار P-Value‌ برای این رابطه کمتر از 0.0001 شده است لذا می‌توان گفت  ارتباط معناداری از نظر آماری میان غلظت آنالیت و تعداد نتایج مثبت وجود دارد. همچنین بر روی نمودار غلظت برای حد تشخیص LOD₅₀ و LOD₉₅ مشخص شده است. LOD₅₀ برای مثال ارائه شده برابر با 1.289Log₁₀ copies/μL بدست آمده است این مقدار غلظتی از آنالیت است که 50% آزمون‌ها برای آن نتیجه مثبت می‌دهد. این غلظت همانطور که در جدول زیر نشان داده شده است، در سطح اطمینان 95% می‌تواند از 1.046 تا 1.588 باشد. LOD₉₅ برای مثال ارائه شده برابر با  3.412Log₁₀ copies/μL بدست آمده است این مقدار غلظتی از آنالیت است که 95% آزمون‌ها برای آن نتیجه مثبت می‌دهد. این غلظت در سطح اطمینان 95% می‌تواند از 2.346 تا 4.963 باشد.

امیداوریم نحوه محاسبه حد تشخیص در آنالیزهای کیفی ( LOD₅₀ و LOD₉₅) برای تصدیق و صحه گذاری نتایج آزمونهای کیفی در آزمایشگاه را به خوبی درک کرده و از این مطلب لذت برده باشید. در صورت وجود هر گونه پرسشی در خصوص تصدیق و صحه گذاری روش های آزمون می‌توایند سوالات خودتان در قسمت کامنت های این پست قراردهید سعی خواهد شد تا جای ممکن به سئوالات مطرح شده پاسخ مناسب داده شود. همچنین در صورت نیاز به برگزاری دوره های آموزشی تصدیق و صحه گذاری روش های آزمون برای کارکنان آزمایشگاه یا برای دریافت خدمات مشاوره برای اخذ گواهینامه ایزو ۱۷۰۲۵ و مشاوره ایزو ۱۵۱۸۹ می‌توانید با ما تماس بگیرید.

6- منابع و مراجع اصلی

1- ISO 16140-3:2021   Microbiology of the food chain — Method validation — Part 3: Protocol for the verification of reference methods and validated alternative methods in a single laboratory

2- CLSI EP17-A2   Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures, 2nd Edition

3- EURACHEM  The Fitness for Purpose of Analytical Methods: A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics: Second edition (2014)